正統鹿耳門聖母廟緣起於十六世紀前，因奉祀鹿耳門媽祖而興建。為臺灣唯一奉祀有八百年以上歷史鹿耳門媽金身，及建築面積第一大規模之媽祖廟。
二次大戰後，顯宮在民國36年（1947年）建了鹿耳門天后宮，主張開基鹿耳門媽供奉在該廟。民國45年（1956年）8月9日臺大楊雲萍教授率學生考察，之後為認為鄭成功登陸於顯宮，且支持顯宮鹿耳門天后宮的主張。以此事為開端，引發土城與顯宮兩地的正統之爭。之後廟方在民國49年（1960年）改名為「鹿耳門聖母廟」，以昭顯香火傳承。
民國64年（1975年）聖母廟在今址重建，於次年（1976年）1月21日（農曆十二月廿一）奠基破土。該工程得臺北木柵指南宮董事長高忠信等執事協助建廟規劃、繪製藍圖，採用仿清代北方宮殿式建築。之後在民國70年十月廿六（1981年11月22日）舉行神尊移駕科儀，十一月初八（12月3日）舉行安座大典，廟額為「正統鹿耳門聖母廟」。
根據《臺南土城正統鹿耳門聖母廟廟誌》等書的說法，早在鄭成功來臺之前，北汕（線）尾島上已經有媽祖廟存在。當時廟有三落，前殿供奉水仙尊王、正（中）殿供奉媽祖、後殿供奉佛祖。媽祖神像有三尊，是軟身神像。另有說法認為鄭成功來臺後，為感謝神恩而重建廟宇，添建兩側廂室，供奉隨艦而來的3尊媽祖神像，土城當地信眾相信這3尊神像便是後來的「文館媽」、「武館媽」與「五角頭媽」。
而關於鹿耳門媽祖廟的早期記載，文字記述為《臺灣縣志》的「康熙五十八年各官捐俸同建」，地圖則有〈康熙臺灣輿圖〉（約1699年~1704年）的「媽宮」。由此顯示康熙五十八年（1719年）以前鹿耳門一地已有媽祖廟，可能是民間所興建的小廟。《臺南土城正統鹿耳門聖母廟廟誌》則認為康熙五十八年（1719年）是官員捐俸易地重建。
主奉：天上聖母、玉皇上帝
陪奉：五府千歲、水仙尊王、開台聖王、開臺聖王、管船大王、將軍府將爺、境主公、盧清將軍、韓德將軍、「五王船」、福德正神、註生娘娘、三官大帝、關呂張三恩主、張天師、普化天尊、王天君、南斗星君、北斗星君、斗姥元君、左輔洞明星君、右弼隱光星君、六十太歲、南極仙翁、白鶴童子、月老星君
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